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Le syndrome de Williams Beuren est une maladie génétique rare due à une microdélétion sur la chromosome 7q11.23. Le nombre important de gènes absents du génome de l’individu donne toute sa complexité à la pathologie. Les recherches actuelles permettent dorénavant de comprendre le rôle de plusieurs gènes et leur implication dans la maladie, et permettent de faire un lien entre l’expression d’un gène et l’apparition d’une anomalie aussi bien sur le plan physique que psychologique.

Ce syndrome associe des troubles du développement, atteint une grande partie des systèmes de l’organisme et présente un phénotype comportemental tout à fait particulier. Cette association de symptôme requiert une prise en charge multidisciplinaire dans laquelle tous les professionnels de santé doivent collaborer afin de garantir une qualité de vie au patient et à son entourage. Bien que le traitement reste pour le moment symptomatique, les recherches se poursuivent au moyen de modèles animaux en utilisant la thérapie génique afin de palier à un ou plusieurs symptômes mais l’espoir que ce syndrome puisse un jour être guéri reste pour le moment très faible.

Nous avons ainsi voulu montrer une fois de plus que le pharmacien d’officine pouvait également prendre part au parcours de soins du patient aux côtés d’autres professionnels, comme dans d’autres pathologies, au travers de conseils simples et d’un accompagnement quotidien.

Le droit pharmaceutique européen et français se construit autour de la notion de médicament.

Il tend à se complexifier davantage avec les nouvelles découvertes scientifiques et technologiques qui ont lieu chaque jour. Il est donc capital pour le législateur de ne pas prendre du retard pour réglementer les produits de santé et ainsi assurer la sécurité des malades.

En 2007 le règlement européen 1394/2007 pose les bases d’une nouvelle classification et une clarification du cadre réglementaire des médicaments de thérapie innovante (MTI) qui sont maintenant divisés en quatre classes.

Directement applicable dans tous les états de l’Union Européenne, ce règlement constitue un cadre réglementaire essentiel pour les laboratoires pharmaceutiques qui mettent au point ce type de produits, leur permettant de les caractériser et ainsi travailler dans les normes.

Dans un même temps, les préparations cellulaires et tissulaires à visée thérapeutique ont un cadre réglementaire spécifique qui comporte des similitudes avec celui des MTI, ce qui complexifie la mise sur le marché de certains produits de santé. La réglementation actuelle des produits de santé est très complexe ; pour un produit de santé, plusieurs directives et règlements européens ainsi que les lois propres à l’Etat membre sont à respecter.

L’hyperoxalurie primitive de type 1 est une pathologie métabolique rare, de transmission autosomale récessive, caractérisée par une surproduction d’oxalate due au déficit fonctionnel d’une enzyme spécifique du peroxysome des hépatocytes, l’alanine glyoxylate aminotransférase (AGT). Le gène AGXT codant pour l’AGT humaine est situé au locus 2q37.3. De nombreux variants/mutants pathologiques de ce gène ont été identifiés : variants polymorphes, mutations non-sens et faux-sens, mutations des sites d’épissage, délétions et insertions. Actuellement, la seule thérapie curative disponible consiste en une greffe hépatorénale allogénique qui, bien qu’efficace, est associée à d’importants facteurs de variabilité, ainsi qu’à une morbidité et une mortalité significatives.

Nous proposons ici de développer une approche alternative de thérapie génique, élaborée à partir d’hépatocytes génétiquement corrigés dérivés de cellules autologues aux patients ; pour cette étude, nous nous focalisons sur le cas de deux patients, l’un homozygote pour la mutation I244T de la protéine AGT, et le second hétérozygote composite G170R/C173Y. Dans un premier temps, nous souhaitons modifier par recombinaison homologue dirigée le génome de fibroblastes de patients, afin qu’ils expriment de façon physiologique une version sauvage du gène AGXT. Ces fibroblastes seront alors reprogrammés en cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) par transduction de vecteurs Sendaï recombinants, exprimant les facteurs de pluripotence Oct3/4, Sox2, Klf4, et c-Myc. Après sélection clonale, les iPSCs corrigées seront finalement orientées vers la lignée hépatocytaire à l’aide de combinaisons de cytokines.

Deux stratégies complémentaires ont été envisagées pour modifier génétiquement les fibroblastes par recombinaison homologue : 1) une thérapie additive ciblée « universelle », impliquant l’insertion de la séquence d’ADN complémentaire (ADNc) du gène AGXT humain dans la région 5’UTR endogène, et permettant l’expression physiologique du transgène et 2) une correction ciblée du gène AGXT endogène, adaptée à chaque type de mutation, et consistant en une substitution de la région mutée par sa version sauvage. Afin de favoriser la survenue d’événements de recombinaison ciblée, chaque approche inclut la création de cassures double-brins de l’ADN au niveau de la région cible, par les systèmes TALENs (stratégie 1), et CRISPR/Cas9 (stratégie 2).

Les travaux réalisés depuis l’initiation du projet ont abouti au développement complet des outils de manipulation génique, qui ont été introduits au sein de fibroblastes primaires sauvages et homozygotes pour la mutation I244T de la protéine AGT, ainsi que dans une lignée cellulaire HepG2 capable d’exprimer la séquence ADNc AGXT. Les premiers résultats obtenus indiquent une toxicité cellulaire des différents systèmes de recombinaison, susceptible de traduire l’existence de clivages génomiques favorables à l’apparition d’événements de recombinaison homologue. Des analyses supplémentaires sont nécessaires pour, d’une part, affirmer l’existence de ces cassures et mettre en évidence l’apparition d’événements de recombinaison homologue, et d’autre part évaluer le taux d’expression de la protéine AGT dans les cellules HepG2 recombinées.

La dégénérescence du cartilage ainsi que le caractère inflammatoire sont les principales caractéristiques de l’arthrose. Cette pathologie dégénérative est la plus fréquente. Elle atteint les sujets âgés comme les plus jeunes, mais aussi les sujets obèses comme les plus sportifs. Les étiologies et facteurs de risques sont nombreux. Dans le contexte sociétal et démographique actuel et envisagé, l’arthrose est un véritable problème de santé publique. De plus les traitements disponibles n’offrent qu’une correction symptomatique, donc cette pathologie présente aussi un enjeu scientifique et médical.

La thérapie cellulaire, Biothérapie en large expansion et outil en Médecine régénérative, marque un changement dans les stratégies thérapeutiques. Son objectif est de dépasser les limites imposées par les traitements pharmaco-chimiques, ceci en utilisant des types cellulaires très variés. Les plus étudiés sont les cellules souches pluripotentes (embryonnaires, ou induites) et les cellules souches mésenchymateuses (multipotentes). Ces dernières ont été identifiées dans de nombreux organes et possèdent des fonctions particulièrement intéressantes, comme leur capacité de différenciation ou encore leur pouvoir anti-inflammatoire et immuno-modulateur. L’intérêt de la communauté scientifique pour ces stratégies grandissant depuis plusieurs décennies aboutit aux premiers essais cliniques. Les domaines de l’ophtalmologie de la cardiologie et de la rhumatologie sont les principales cibles.

Une start-up, STEMCIS, dont l’activité se concentre sur le développement de dispositifs médicaux soit dans le domaine de la chirurgie esthétique (Adip’Sculpt), soit dans le domaine vétérinaire (Scivet), souhaite s’étendre à la médecine régénérative via la thérapie cellulaire à partir du tissu adipeux. Une étude préclinique est réalisée sur un modèle chirurgical d’arthrose chez le rat. Il s’agit d’étudier l’effet de différentes conditions d’injection de cellules extraites à partir de lipoaspiration, les cellules de la fraction stromale vasculaire. Une semaine après l’induction du modèle chirurgical des deux genoux, les cellules placées dans différentes conditions sont injectées en intra-articulaire. Trois mois après l’induction, les analyses micro-CT et histologiques révèleront l’état clinique des articulations. Les premiers résultats semblent souligner la nécessité d’une séparation en quatre régions articulaires mais aussi une potentielle action synergique de l’association des cellules avec un bio-polymère. D’autres études ultérieures doivent être menées, dans le but de soutenir un essai clinique, et in fine développer un kit à usage unique pour le traitement de l’arthrose de façon autologue, mais aussi pour clarifier le rôle (bénéfique ?) de la fraction stromale vasculaire complète.

Après avoir rappelé certains éléments clefs de la cancérologie fondamentale et les principes de l’oncologie médicale, cette thèse développe une étude s’intéressant au mélanome uvéal et à la mise au point d’une méthode thérapeutique innovante destinée à optimiser les performances des traitements de cette pathologie. En effet, en raison du risque très élevé de métastases hépatiques (50% des patients), le pronostic des patients atteints de mélanome uvéal (MU) reste défavorable. Afin d’améliorer leur devenir, de nouvelles thérapies sont donc nécessaires. Cependant, à cause de l’incidence très faible de la maladie, il n’est pas possible de multiplier les essais cliniques pour tester l’ensemble des nouveaux traitements (ciblés), seuls ou en combinaison. L’utilisation de modèles précliniques qui reproduisent les caractéristiques moléculaires et les voies de signalisation impliquées dans le MU est donc absolument requise. L’une des catégories principales de modèles précliniques de cancers est représentée par les xénogreffes obtenues à partir d’échantillons de tumeurs humaines directement transplantés sur souris immunodéficientes. Ces modèles reproduisent l’hétérogénéité des cancers humains.

Au cours de ce travail de thèse, j’ai cherché à caractériser des modèles de mélanome uvéaux par leurs niveaux d’expression protéique au sein du Laboratoire d’Investigation Préclinique de l’institut Curie de Paris. Cette caractérisation moléculaire a été effectuée en utilisant le western blot et les puces protéiques en phase inverse. Elle m’a permis de mettre en évidence la surexpression de certaines protéines d’intérêt dans certains modèles. Les voies de signalisation dont ces protéines font partie sont désormais des cibles potentielles pour de futures études précliniques. La réalisation d’une étude de toxicité du bévacizumab a montré que ce médicament n’est pas toxique lorsqu’il est utilisé à la dose de 30 mg/kg une fois par semaine. Dans les mêmes conditions, une étude d’efficacité de ce médicament sur quatre modèles de xénogreffes dérivées de patients différents de mélanomes uvéaux a montré une variabilité de la réponse au traitement. L’analyse de l’expression génique de ces modèles traités versus non traités et sensibles versus peu sensibles m’a permis d’isoler certains marqueurs prédictifs de bonne ou de mauvaise réponse au bévacizumab. La perspective de cette étude est donc de valider une signature prédictive de réponse au bévacizumab dans le cas du mélanome uvéal.

L’hémochromatose, maladie génétique liée à une anomalie du métabolisme du fer, entraine son accumulation dans les différents tissus de l’organisme. Il existe plusieurs types d’hémochromatose mais la plus fréquente correspond à celle touchant le gène codant pour la protéine HFE connue sous le nom d’hémochromatose héréditaire. C’est une pathologie très fréquente car elle touche environ une personne sur 300 en France. Le déficit en hepcidine est la cause principale de cette anomalie métabolique.

Les symptômes sont très variables d’un patient à un autre et non spécifiques. Très souvent, les premiers signes sont une asthénie persistante, des douleurs articulaires avec le signe de « la poignée de main douloureuse », des troubles sexuels avec diminution de la libido ainsi que des signes cardiovasculaires tels que des essoufflements pour un effort minime ou des extrasystoles. Un diagnostic tardif peut faire apparaitre des complications importantes comme des troubles ostéo-articulaires, des troubles endocriniens avec un diabète et un hypogonadisme, une mélanodermie, une insuffisance cardiaque, des troubles hépatiques pouvant aboutir à une cirrhose voire au carcinome hépatocellulaire.

Le diagnostic, souvent tardif, en raison de la symptomatologie aspécifique, comprend le dosage de la ferritinémie et du coefficient de saturation de la transferrine. La confirmation est réalisée par la recherche de la mutation C282Y dans le gène codant pour la protéine HFE grâce à un test génétique. Une fois le diagnostic posé, le dépistage doit être proposé aux apparentés du probant pour la prise en charge optimale d’éventuels cas.

Les phlébotomies constituent encore de nos jours le traitement de 1ère intention, elles peuvent même être réalisées à domicile pour améliorer l’observance et le confort du patient. Des espoirs thérapeutiques se développent avec des agents mimant les fonctions de l’hepcidine ou stimulant sa production. Le projet « Iron coli » réalisé par les étudiants du génopole d’Evry pourrait constituer un traitement d’avenir.

Notre étude sur l’évaluation de l’éducation thérapeutique officinale dans l’hémochromatose montre de nombreuses faiblesses qui peuvent être corrigées pour atteindre un retour aussi positif que celui observé dans le diabète. L’information, l’écoute du patient, la bonne formation de l’équipe officinale ne pourra qu’améliorer la prise en charge des patients atteints de cette maladie. Le pharmacien d’officine, de part sa proximité avec la population, peut devenir un acteur privilégié pour le dépistage et pour l’éducation thérapeutique de l’hémochromatose.

Les mélanomes cutanés sont les cancers de la peau les plus mortels. La forte mortalité et l'augmentation de l’incidence en font un problème de santé majeur. Une approche thérapeutique prometteuse pour des stades avancés est l’immunothérapie adoptive basée sur l’utilisation de cellules T effectrices autologues appelées TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes). Ces TIL nécessitent d’être activés via une co-culture avec 120.106 de cellules nourricières LAZ irradiées.

L’objectif des études réalisées est de définir :

- un protocole de sevrage des cellules nourricières LAZ, pour nous alléger les contraintes de production et vis-à-vis des contrôles qualité

- les procédés de congélation idéaux pour la conservation des cellules LAZ en Master Cell Bank (MCB) et Working Cell Bank (WCB).

Grâce à la création de ces banques, nous aimerions ne décongeler que 2 ou 3 ampoules de cellules irradiées prêt à l’emploi plutôt que de décongeler des LAZ 10j avant une production de TIL, les amplifier puis les irradier à chaque production.

Ainsi des essais ont été réalisés pour déterminer le protocole de sevrage des cellules, la solution de congélation, la quantité de cellules par ampoule et le système de congélation manuel (Boite Nalgène) ou automatisé (Controlled Rate Freezer).

Nos résultats concernant le sevrage se sont montrés décevants, ne nous permettant pas d’obtenir des cellules capables de s’amplifier. Nous avons donc décidé de poursuivre nos réalisations de MCB et WCB avec des cellules LAZ non sevrées en sérum. S’agissant de la cryoconservation, nos résultats nous ont conduits à sélectionner la solution de congélation commerciale Cryostor CS10 pour effectuer la MCB et WCB. L’absence de différence significative entre les différents systèmes de congélation testés nous ont permis de faire le choix du système manuel en Boite Nalgène. L’étude réalisée pour déterminer la quantité de cellules à ensemencer par ampoule nous amène à conclure que la congélation de 100.106 de cellules LAZ irradiées par ampoule est optimale.

Nos études ont servi à l’élaboration des procédés de fabrication des MCB et WCB de cellules LAZ et d’atteindre nos exigences. Les banques MCB et WCB peuvent donc être effectuées au sein des laboratoires conformes aux BPF.

Le cancer est la première cause de mortalité en France. Pour faire face à ce fléau, les traitements classiques comme la chimiothérapie ou la radiothérapie ont d’abord été utilisés mais ils sont très mal tolérés et ne s’attaquent pas uniquement aux cellules cancéreuses. L’avènement des thérapies ciblées a permis d’améliorer le quotidien des malades, sans que cela ne soit malheureusement suffisant. Les vaccins sont donc apparus comme la solution la plus sûre, la mieux tolérée et la plus personnalisée.

En France, deux vaccins préventifs anti-tumoraux sont déjà sur le marché : le vaccin contre l’hépatite B comme l’Engerix® qui est un vaccin à base de protéines naturelles, et le vaccin contre le cancer du col de l’utérus comme le Gardasil® qui est un vaccin à base de protéines recombinantes.

En ce qui concerne les vaccins anti-cancer thérapeutiques, cinq axes de recherche sont actuellement étudiés, mettant en œuvre des procédés biotechnologiques de production innovants. Il y a par exemple : les vaccins à base de cellules tumorales comme OncoVax® qui a obtenu une autorisation en Suisse, les vaccins à base de cellules dendritiques comme Provenge® qui est déjà commercialisé aux Etats-Unis, les vaccins à base de peptides ou protéines comme Oncophage® autorisé en Russie, les vaccins à base d’anticorps monoclonaux anti-idiotypiques comme BiovaxID® qui va rentrer sur le marché Européen, les vaccins à base de vecteurs comme le TG4010 toujours en cours d’essai, et les vaccins à base d’ADN et d’ARN toujours à la recherche de leur chef de file.

Malgré toutes ces découvertes très récentes, toutes ne sont pas concluantes et les efforts se poursuivent afin de mieux comprendre les mécanismes et effets à long terme. De nouveaux résultats d’essais cliniques sont publiés chaque mois et quelques vaccins très prometteurs devraient arriver sur le marché français dans les années qui viennent.

Le cancer est une maladie de l'ADN résultant de l'accumulation de mutations génétiques. Elle se caractérise par la prolifération anarchique de cellules anormales au sein d'un organe ou d'un tissu. Cette prolifération cellulaire donne naissance à une masse que l'on appelle tumeur. Certaines cellules peuvent migrer par voie sanguine ou lymphatique et coloniser d'autres organes pour former des métastases.

Les facteurs de risque de la maladie sont de mieux en mieux connus : composante génétique, exposition à des carcinogènes (radiations ionisantes, carcinogènes du tabac, peintures, solvants...), mode de vie (alimentation …).

Les traitements conventionnels sont la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie.

Les connaissances en immunologie ont permis de développer des stratégies thérapeutiques innovantes ; l'immunothérapie consiste à stimuler le système immunitaire des patients pour qu'il cible les cellules tumorales. Plusieurs modalités sont possibles : utilisation des antigènes tumoraux pour créer des vaccins, démasquage des antigènes tumoraux, utilisation de cellules immunitaires modifiées génétiquement.

D'autres stratégies de thérapie génique existent ; la thérapie gène suicide consiste à introduire dans la cellule tumorale un gène codant pour une enzyme qui catalyse la formation de métabolites toxiques après administration d'une prodrogue. Il est également possible de cibler les cellules tumorales en utilisant des virus qui s'y répliquent préférentiellement : c'est la virothérapie oncolytique.

Une autre approche est d'agir sur la néoangiogénèse, processus grâce auquel les tumeurs peuvent croître au-delà d'une certaine taille. Il s'agit par exemple, de cibler le VEGF et son récepteur à l'aide d'anticorps monoclonaux, de récepteurs solubles, d'inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase....

Des progrès pharmacologiques sont à souligner mais la cellule cancéreuse possède encore plusieurs secrets moléculaires à percer pour limiter complètement sa prolifération et prévenir toute récidive.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative complexe et multifactorielle, posant à l’heure actuelle un véritable problème de santé publique, dans lequel le pharmacien a tout son rôle dans l’accompagnement des malades. Trois lésions histopathologiques sont retrouvées : les plaques séniles, les dégénérescences neurofibrillaires et la mort neuronale. Elle se caractérise également par une composante inflammatoire centrale et périphérique. Cette inflammation fait l’objet d’un débat sur son effet bénéfique ou délétère dans la MA. Les dernières données soulèvent aussi que le feu inflammatoire central conduirait à la sénescence microgliale. Cette situation de détresse centrale pourrait être prise en charge par les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs), passant la barrière hématoencéphalique (BHE) pour assurer l’épuration amyloïde. Mais sur le plan moléculaire, tout reste à découvrir pour mieux comprendre le passage de ces cellules PBMCs à travers la BHE

. J’ai étudié durant un stage en M2R l’expression de 5 chimiokines (CCL2, CCL4, CCL5, CXCL10, et CX3CR1) déjà citées dans la littérature pour leurs rôles dans la physiopathologie de la MA, en incluant des PBMCs issues de patients atteints de la MA dans un modèle in vitro de BHE comprenant la majorité des acteurs cellulaires (astrocytes, neurones, microglie, cellules endothéliales)

. La première partie de ce travail était de construire un modèle de BHE humain in vitro fonctionnel pour la suite des expérimentations. Nous avons pu montrer que notre modèle de BHE reste étanche puisqu’il prévient le passage d’un composé dextran-F4D. Cependant, il reste d’autres critères à explorer pour valider complètement notre modèle. Nous avons pu aussi démontrer que certaines chimiokines dont CCL2 et CXCL10 augmentent même sans l’exposition du milieu central au peptide amyloïde avec une induction très forte de CXCL10 dans les cellules endothéliales. Au contraire, les taux de CCL4 et CCL5 diminuent dans les PBMCs, là encore sans l’impact du stress amyloïde central, soulignant une régulation négative de l’environnement de la BHE sur les PBMCs

. Ainsi avec ce modèle intégré, nous démontrons le rôle des PBMCs de patients atteints de la MA sur l’environnement chimiotactique au niveau de la BHE et en retour la régulation des chimiokines par cet environnement sans qu’il y ait atteinte du compartiment central par le stress amyloïde.