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Thoreau Vincent

Les travaux encadrés par "Thoreau Vincent"

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  • Utilisation du système CRISPR/Cas9 pour inactiver le gène Fucosyltransférase chez le tabac    - Pougnault Lucie  -  11 décembre 2015  - Thèse d'exercice

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    Les plantes de tabac et en particulier l’espèce, Nicotiana benthamiana sont devenus de nos jours un moyen rentable et efficace pour la production de protéines thérapeutiques. Néanmoins, certains aspects biochimiques diffèrent chez les plantes en comparaison avec les mammifères. En particulier, des différences sont observées dans la N-glycosylation des protéines : chez les plantes, les N-glycanes présentent des caractéristiques particulières telles que la liaison α(1,3) du fucose en contraste avec la liaison α(1,6) dans les cellules animales (Ma et al., 2006). Plusieurs études ont démontré que ces différences biochimiques entrainent des effets secondaires quand à leur utilisation en thérapeutique humaine. C’est pourquoi l’inactivation du gène Fucosyltransférase (FucT) est nécessaire pour réduire cette immunogénicité et afin d’ « humaniser » ces glycoprotéines d’origine végétale.

    Nous avons testé l’utilisation d’un nouvel outil d’édition de gènes disponible sur le marché pour éteindre l’expression du gène FucT chez Nicotiana benthamiana. Il s’agit du système CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) isolé de la bactérie Streptococcus pyogenes. Ce système comporte deux principaux éléments : une endonucléase, Cas9 qui est guidée par le second élément, un ARN guide. Ce complexe engendre une cassure double brin dans l’ADN au niveau du locus cible. Par la suite, un mécanisme de réparation de l’ADN intervient en l'absence de matrice donneuse: la jonction d’extrémités non homologues (NHEJ). C’est un mécanisme de réparation infidèle qui entraine l’apparition de mutations (insertion et/ou délétions) ainsi qu’une modification du cadre de lecture et donc l’apparition d’un codon stop prématuré.

    L’objectif de mon stage était de démontrer la fonctionnalité du système CRISPR/Cas9 à inactiver le gène FucT au niveau de plusieurs locus chez le tabac.

    La première stratégie a été d’agroinfiltrer des feuilles de tabac avec des suspensions d’Agrobacterium contenant les plasmides permettant l’expression d’un simple ARN guide et de la protéine Cas9. Nous avons démontré lors de l’utilisation de ce simple guide que CRISPR/Cas9 engendrait des mutations dans les séquences cibles sélectionnés, mais avec un faible pourcentage de clivage, estimé à 3% par la technique de digestion par l’endonucléase T7 et à 27% par séquençage. En revanche, une combinaison de deux simples ARNs guides permet d’obtenir un taux de mutation plus élevé (8 à 15 % pour l’essai T7 et de 21 à 46% pour le séquençage). La seconde stratégie développée par Bo Yu de Larix Bioscience implique l'utilisation de multiples ARNs guides incorporés dans un seul et même plasmide et dirigé vers plusieurs cibles. Cette approche s’est révélée infructueuse entre nos mains. Enfin, le troisième et dernier volet de ce rapport concerne la génération de plantes transgéniques chez lesquelles FucT est inactivé de façon stable.

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