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Le cancer est l’une des causes majeures de mortalité et de morbidité dans le monde. Des millions d’hospitalisation par an de long et de court terme sont liées au cancer en France. Les fluoropyrimidines (5-FU et ses analogues) sont des molécules qui sont utilisées dans de nombreux protocoles de chimiothérapie. Le 5-FU administré en monothérapie ou en association dans des situations conventionnelles, adjuvantes ou métastasiques peut souvent induire des toxicités chez les patients atteints de cancer recevant cette chimiothérapie. Ces toxicités sont liées à un déficit de l’activité de la DPD, enzyme responsable de la dégradation du 5-FU. Un phénotypage de la DPD, en dosant dans le plasma son substrat endogène l’uracile (U) et le métabolite formé correspondant, le dihydro-uracile (UH2) permet de déterminer l’activité de l’enzyme. La méthode de dosage proposée ici permet le suivi pré-thérapeutique des patients recevant des traitements à base des fluoropyrimidines. Le dosage de l’U et du UH2 dans le plasma par LC-MS/MS a été développé pour quantifier le ratio UH2/U en utilisant le Chloro-uracile (ClU) comme étalon interne. Les analytes ont été extraits par extraction liquide-liquide en utilisant un mélange d’acétate d’éthyle et d’isopropanol. La séparation UHPLC a été réalisée sur une colonne HSS T3 1.8 μm parcourue par un mélange de deux phases mobiles liquides A (eau avec 0,5% d’acide acétique) et de B (acétonitrile avec 0,5% d’acide acétique). Les transitions (m/z) de quantification étaient 113 → 70 pour U, 115 → 98 pour le UH2, 147 → 130 pour ClU. Le temps d’analyse par échantillon est de 6 minutes. La méthode est linéaire pour des concentrations allant de 0,625 à 60 ng/mL pour les deux analytes. La précision est bonne puisque les coefficients de variation sont inférieurs à 8% pour les niveaux haut et moyen de contrôle de qualité et intérieurs à 11% pour le niveau bas de contrôle de qualité. Les biais de la justesse sont tous inférieurs à 8% pour les trois niveaux de contrôle de qualité. La méthode de dosage de l’U et du UH2 dans le plasma par LC-MS/MS a été validée, elle peut à présent être testée dans les conditions réelles de routine de laboratoire.