UPmémoires

Dans l’urine et le plasma, les micropolluants peuvent apparaitre sous deux formes, la forme conjuguée et la forme non conjuguée, à cause du métabolisme hépatique. Dans les études de biomonitoring, afin de déterminer l’ensemble des micropolluants, c’est-à-dire conjugués et non conjugués, une étape d’hydrolyse enzymatique est requise. Notre choix d’enzyme s’est porté sur une enzyme avec une activité glucuronidase mais aussi sulfatase. Pour vérifier cette déconjugaison par l’enzyme, la 4-methyl-umbellieferone (4MU), ainsi que la 4-methyl-umbelliferone-glucuronide (4MUG) et la 4-methyl-umbelliferone-sulfate (4MUS) ont été proposés comme marqueurs. Dans la littérature, seule une étude de Zimmerman et Al. explique le développement et la validation d’une méthode d’analyse du 4MU, 4MUG, 4MUS afin de mesurer la concentration de 4MU formée, et la diminution des concentrations de 4MUG et 4MUS. Cependant cette dernière utilise une chromatographie liquide couplée à un détecteur ultra-violet (LC-UV), qui est aujourd’hui de moins en moins utilisée dans les laboratoires, au profit des chaines de chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS). L’objectif de cette étude était de développer et valider une méthode de dosage par LC-MS/MS de ces marqueurs dans l’urine et le plasma. Dans notre méthode, nous avons désactivé l’enzyme par la chaleur, puis celle-ci a été ajoutée au plasma ou à l’urine, avec des concentrations connues de 4MU, 4MUG, 4MUS et de l’umbelliferone utilisé comme étalon interne. Pour le plasma, les concentrations finales de nos points de gamme dans les tubes vont de 0,52 à 8,33 nmol/mL de 4MUG et de 4MUS, et de 1,04 à 16,67 nmol/mL de 4MU. Tandis que dans l’urine, les concentrations vont de 0,625 à 10 nmol/mL de 4MUG et de 4MUS, et de 1,25 à 20 nmol/mL pour la 4MU. Les concentrations de nos marqueurs ont été déterminées par LC (Shimadzu) couplée à un spectromètre de masse à triple quadripôle (3200 QTRAP Applied Biosystems). La justesse et la précision ont été déterminées par des contrôles qualités à 3 concentrations différentes. Les conditions chromatographiques permettent la séparation de nos 4 composés (4MU, 4MUG, 4MUS et umbelliferone). La linéarité de la méthode a été demontrée avec des r2>0,995 dans le plasma et dans l’urine. La méthode est juste (biais < 16% pour le point le plus bas) et précise (CV < 9%) dans les deux matrices.

En conclusion, les formes conjuguées et non conjuguées des micropolluants possèdent des propriétés et caractéristiques chimiques différentes, c’est pour cela qu’il est important d’identifier les deux formes séparément. La méthode analytique développée dans cette étude est utilisable pour permettre la déconjugaison des micropolluants en utilisant 4MU, 4MUG et 4MUS comme marqueur de déconjugaison.