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Application de la thérapie génique dans l’hyperoxalurie primitive de type 1 : utilisation des technologies TALENs et CRISPR/Cas

L’hyperoxalurie primitive de type 1 est une pathologie métabolique rare, de transmission autosomale récessive, caractérisée par une surproduction d’oxalate due au déficit fonctionnel d’une enzyme spécifique du peroxysome des hépatocytes, l’alanine glyoxylate aminotransférase (AGT). Le gène AGXT codant pour l’AGT humaine est situé au locus 2q37.3. De nombreux variants/mutants pathologiques de ce gène ont été identifiés : variants polymorphes, mutations non-sens et faux-sens, mutations des sites d’épissage, délétions et insertions. Actuellement, la seule thérapie curative disponible consiste en une greffe hépatorénale allogénique qui, bien qu’efficace, est associée à d’importants facteurs de variabilité, ainsi qu’à une morbidité et une mortalité significatives.

Nous proposons ici de développer une approche alternative de thérapie génique, élaborée à partir d’hépatocytes génétiquement corrigés dérivés de cellules autologues aux patients ; pour cette étude, nous nous focalisons sur le cas de deux patients, l’un homozygote pour la mutation I244T de la protéine AGT, et le second hétérozygote composite G170R/C173Y. Dans un premier temps, nous souhaitons modifier par recombinaison homologue dirigée le génome de fibroblastes de patients, afin qu’ils expriment de façon physiologique une version sauvage du gène AGXT. Ces fibroblastes seront alors reprogrammés en cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) par transduction de vecteurs Sendaï recombinants, exprimant les facteurs de pluripotence Oct3/4, Sox2, Klf4, et c-Myc. Après sélection clonale, les iPSCs corrigées seront finalement orientées vers la lignée hépatocytaire à l’aide de combinaisons de cytokines.

Deux stratégies complémentaires ont été envisagées pour modifier génétiquement les fibroblastes par recombinaison homologue : 1) une thérapie additive ciblée « universelle », impliquant l’insertion de la séquence d’ADN complémentaire (ADNc) du gène AGXT humain dans la région 5’UTR endogène, et permettant l’expression physiologique du transgène et 2) une correction ciblée du gène AGXT endogène, adaptée à chaque type de mutation, et consistant en une substitution de la région mutée par sa version sauvage. Afin de favoriser la survenue d’événements de recombinaison ciblée, chaque approche inclut la création de cassures double-brins de l’ADN au niveau de la région cible, par les systèmes TALENs (stratégie 1), et CRISPR/Cas9 (stratégie 2).

Les travaux réalisés depuis l’initiation du projet ont abouti au développement complet des outils de manipulation génique, qui ont été introduits au sein de fibroblastes primaires sauvages et homozygotes pour la mutation I244T de la protéine AGT, ainsi que dans une lignée cellulaire HepG2 capable d’exprimer la séquence ADNc AGXT. Les premiers résultats obtenus indiquent une toxicité cellulaire des différents systèmes de recombinaison, susceptible de traduire l’existence de clivages génomiques favorables à l’apparition d’événements de recombinaison homologue. Des analyses supplémentaires sont nécessaires pour, d’une part, affirmer l’existence de ces cassures et mettre en évidence l’apparition d’événements de recombinaison homologue, et d’autre part évaluer le taux d’expression de la protéine AGT dans les cellules HepG2 recombinées.

Mots-clés libres : thérapie génique, TALENs, CRISPR/Cas, recombinaison homologue ciblée, hyperoxalurie primitive de type I.

Rameau (langage normalisé) :
• Thérapie génique
  
• Hyperoxalurie primitive